Mechanical properties and immunotherapeutic effects of dissolving microneedles with different drug loadings based on hyaluronic acid

Abstract Improving vaccine immunity and reducing antigen usage are major challenges in the clinical application of vaccines. Microneedles have been proven to be painless, minimally invasive, highly efficient, and have good patient compliance. Compared with traditional transdermal drug delivery, it can effectively deliver a large-molecular-weight drug into the skin, resulting in a corresponding immune response. However, few studies have examined the relationship between microneedle loading dose and immune effects. In this study, the hyaluronic acid (HA) conical and pyramidal dissolving microneedles were prepared by the two-step vacuum drying method, respectively. The model drug ovalbumin (OVA) was added to HA to prepare dissolving microneedles with different loading amounts. The mass ratios of HA to OVA were 5:1, 5:3, and 5:5. The mechanical properties of the dissolving microneedles were characterized using nanoindentation and in vitro puncture studies. The immune effects of the matrix and drug content were studied in Sprague-Dawley (SD) rats. Finally, the diffusion behavior of OVA and the binding mode of HA and OVA in the microneedles were simulated using Materials Studio and Autodocking software. The experimental results showed that the conical microneedles exhibited better mechanical properties. When the mass ratio of HA to OVA was 5:3, the immune effect can be improved by 37.01% compared to subcutaneous injection, and achieved a better immune effect with relatively fewer drugs. This conclusion is consistent with molecular simulations. This study provides theoretical and experimental support for the drug loading and efficacy of microneedles with different drug loadings

Identification of new human mesenchymal stem cell biomarker by aptamers / Identificação de novos biomarcadores de células tronco mesenquimais de origem humana por meio de aptâmeros

Stem cells are undifferentiated cells that can be distinguished from others by their ability to self-renew and to differentiate into new specific cell types. Mesenchymal stem cells (MSC) are adult stem cells that can be obtained from different sources, such as adipose tissue, bone marrow, dental pulp, and umbilical cord. They can either replicate, originating new identical cells, or differentiate into cells of mesodermal origin and from other germ layers. MSC have been studied as new tools for regenerative therapy. Although encouraging results have been demonstrated, MSC-based therapies still face a great barrier: the difficulty of isolating these cells from heterogeneous environments. MSC are currently characterized by immunolabelling through a set of multiple surface membrane markers, including CD29, CD73, CD90 and CD105, which are also expressed by other cell types. Hence, the present work aimed to identify new specific biomarkers for the characterization of human MSC using DNA aptamers produced by the SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) technique. Our results showed that MSC from different origins bound to DNA candidate aptamers, that is, DNA or RNA oligonucleotides selected from random libraries that bind specifically to biological targets. Aptamer-bound MSC could be isolated by fluorescenceactivated cell sorting (FACS) procedures, enhancing the induction of differentiation into specific phenotypes (chondrocytes, osteocytes and adipocytes) when compared to the whole MSC population. Flow cytometry analyses revealed that candidate aptamers bound to 50% of the MSC population from dental pulp and did not present significant binding rates to human fibroblasts or lymphocytes, both used as negative control. Moreover, immunofluorescence images and confocal analyses revealed staining of MSC by aptamers localized in the surfacemembrane of these cells. The results also showed internal staining of human monocytes by our investigated aptamers. A non-specific control aptamer (CNTR APT) obtained from the random pool was then utilized to compare the specificity of the aptamers bound to the analyzed non-apoptotic cells, showing no staining for MSC. However, 40% of the monocytes bound to the CNTR APT. Normalized data based on the cells bound to candidate aptamers compared to those bound to the CNTR APT, revealed a 10 to 16-fold higher binding rate for MSC against 2-fold for monocytes. Despite its low specificity, monocyte-aptamer binding occurs probably due to the expression of shared markers with MSC, since monocytes are derived from hematopoietic stem cells and are important for the immune system ability to internalize/phagocyte external molecules. Given that, we performed a pull-down assay followed by mass spectrometry analysis to detect which MSC-specific protein or other target epitope not coexpressed by monocytes or the CNTR APT would bind to the candidate aptamer. Distinguishing between MSC and monocyte epitopes is important, as both cells are involved in immunomodulatory effects after MSC transplantations. ADAM17 was found to be a target of the APT10, emerging as a possible biomarker of MSC, since its involvement in the inhibition of the TGF signaling cascade, which is responsible for the differentiation of MSC. Thus, MSC with a higher stemness profile should overexpress the protein ADAM17, which presents a catalytic site with affinity to APT10. Another target of Apt 10 is VAMP3, belonging to a transmembrane protein complex that is involved in endocytosis and exocytosis processes during immune and inflammatory responses. Overall, proteins identified as targets of APT10 may be cell surface MSC biomarkers, with importance for MSC-based cell and immune therapies

Células tronco são células indiferenciadas que podem ser distinguidas de outros tipos celulares por meio da habilidade de se auto renovarem e de se diferenciarem em novos tipos celulares. Células tronco mesenquimais (MSC) são células tronco adultas encontradas em diferentes tecidos como tecido adiposo, polpa de dente e cordão umbilical. Estas células podem se autodividir em células idênticas ou se diferenciarem em células de origem mesodermal. Estas células têm sido estudadas em novas aplicações que envolvem terapia regenerativas. Embora resultados encorajadores tenham sido demonstrados, terapias que utilizam MSC ainda encontram uma grande barreira: a dificuldade no isolamento destas células a partir de um ambiente heterogêneo. MSC são caracterizadas por populações positivas em ensaios de imunomarcação para os epítopos membranares CD29, CD73, CD90 e CD105, presentes também em outros tipos celulares. Assim, o presente trabalho tem o objetivo de identificar novos biomarcadores de MSC de origem humana, utilizando aptâmeros de DNA produzidos pela técnica SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) como ferramenta. Nossos resultados mostraram que MSC de diferentes origens ligam-se a aptâmeros (oligonucleotídeos de DNA ou RNA que atuam como ligantes específicos de alvos moleculares) de DNA candidatos que atuam no isolamento de MSC por meio da técnica FACS de separação celular, promovendo uma maior indução de diferenciação em células específicas (condrócitos, osteócitos e adipócitos) comparada com a população total de MSC. Análises de citometria de fluxo mostraram que os aptâmeros candidatos se ligam a 50% das MSC de polpa de dente e não apresentam taxa de ligação significante para fibroblastos e linfócitos de origem humana - utilizados como controles negativo. Além domais, imagens de imunofluorescência e confocal mostraram ligação na superfície da membrana de MSC e a marcação interna de monócitos a estes aptâmeros. Portanto, um aptâmero controle (CNTR APT) foi utilizado para comparar a especificidade dos aptâmeros ligados a células viáveis, mostrando a não ligação deste aptâmero a MSC. Porém, 40% da população de monócitos ligou-se ao CNTR APT. Uma normalização baseada na comparação entre as taxas de ligação entre células ligadas com aptâmeros candidatos e o aptâmero controle gerou uma taxa de especificidade entre 10-16 vezes maior para MSC contra 2,5 vezes para os monócitos. Deste modo, embora os resultados tenham mostrado uma taxa de ligação entre monócitos e aptâmeros, as MSC ligadas aos aptâmeros candidatos possuem uma maior taxa de especificidade devido a uma maior presença de antígenos que são expressos em ambas as células. Um ensaio de Pull Down seguido de espectrometria de massas foi utilizado para a identificação de biomarcadores que se ligariam aos aptâmeros candidatos, e que não seriam co-expressos por monócitos e por antígenos ligados ao aptâmero controle. Deste modo, a proteína ADAM17 foi identificada nas amostras de APT10 ligadas às MSC. Tal proteína está relacionada à inibição de uma cascata de sinalização da família de proteínas TGF, responsável pela diferenciação de MSC. Assim, MSC com maior potencial tronco deveriam expressar ADAM17 em maior quantidade. Tal proteína apresenta um sítio catalítico que demonstra interagir com o APT10, de acordo com predição Docking entre proteína e DNA. Foi identificada também, a proteína VAMP3, que pertence a um complexo proteico transmembranar responsável pelos processos de endocitose e exocitose, e que podem ter um papel importante na liberação de citocinas e outras moléculas relacionadas às respostas imune e inflamatórias. Deste modo, o APT10 identificou proteínas importantes que devem estar relacionas com a melhora de imunoterapias que utilizam MSC

Caracterização imunológica da formulação vacinal baseada em VLP (Virus Like Particle) da Proteína Circumsporozoíta de Plasmodium vivax / Immunological characterization of the VLP (Virus Like Particle) vaccine formulation fused to Circumsporozoite Protein of Plasmodium vivax

O Plasmodium vivax é a espécie mais comum de parasita causador da malária humana encontrada fora da África, com maior endemicidade na Ásia, América Central e do Sul e Oceania. Embora o Plasmodium falciparum cause a maioria do número de mortes, o P. vivax pode levar à malária grave e resultar em morbimortalidade significativa. O desenvolvimento de uma vacina protetora será um passo importante para a eliminação da malária. Recentemente, uma formulação contendo as três variantes alélicas da proteína circumsporozoíta de P. vivax (PvCSP - All epitopes) induziu proteção parcial em camundongos após desafio com esporozoíto híbrido Plasmodium berghei (Pb), no qual as repetições centrais do PbCSP foram substituídas por repetições PvCSP-VK210 (esporozoítos Pb/Pv). No presente estudo, a proteína quimérica PvCSP contendo as variantes alélicas (VK210, VK247 e P. vivax-like) fusionadas com a proteína de nucleocapsídeo do vírus da caxumba (formando partículas semelhantes a nucleocapsídeos ou do inglês, NLP - Núcleo Like Particles) na ausência (NLP-CSPR) ou na presença do domínio C-terminal (CT) conservado da PvCSP (NLP-CSPCT). Para a realização do estudo selecionamos os adjuvantes Poly (I:C), um RNA sintético de dupla fita, agonista do receptor Toll do tipo 3 (TLR3) ou o adjuvante Montanide ISA 720, uma emulação óleo em agua. Para obter uma forte resposta imune, a levedura Pichia pastoris foi usada para expressar as proteínas recombinantes na forma de NLPs. Camundongos foram imunizados com cada uma das proteínas recombinantes em combinação com os adjuvantes citados. Embora ambas as NLPs tenham sido capazes de gerar uma forte resposta imune, com altos níveis de títulos e longevidade, apenas a formulação contendo a proteína NLP-CSPCT na presença do adjuvante Poly (I:C) foi selecionada para ser explorada em experimentos futuros. Esta proteína em combinação com o adjuvante Poly (I:C) induziu alta frequência de células secretoras de anticorpos específicas para o antígeno homólogo nos dias 5 e 30, no baço e na medula óssea, respectivamente. Altos títulos de IgG contra as 3 variantes de PvCSP foram detectados nos soros. Posteriormente camundongos imunizados com NLP-CSPCT foram desafiados com esporozoítos Pb/Pv e a parasitemia no 5º dia demonstrou proteção estéril em 30% dos camundongos desafiados. Portanto, a formulação vacinal gerada neste estudo tem potencial para ser explorada no desenvolvimento de uma vacina universal contra a malária causada por P. vivax

Plasmodium vivax is the most common species of human malaria parasite found outside Africa, with high endemicity in Asia, Central and South America, and Oceania. Although Plasmodium falciparum causes the majority of deaths, P. vivax can lead to severe malaria and result in significant morbidity and mortality. The development of a protective vaccine will be a major step toward malaria elimination. Recently, a formulation containing the three allelic variants of the P. vivax circumsporozoite protein (PvCSP--All epitopes) showed partial protection in mice after a challenge with the hybrid Plasmodium berghei (Pb) sporozoite, in which the PbCSP central repeats were replaced by the VK210 PvCSP repeats (Pb/Pv sporozoite). In the present study, the chimeric PvCSP allelic variants (VK210, VK247, and P. vivax-like) were fused with the mumps virus nucleocapsid protein (assembling into nucleo like particles - NLP) in the absence (NLP-CSPR) or presence of the conserved C-terminal (CT) domain of PvCSP (NLP-CSPCT). To carry out the study, we selected the adjuvants Poly (I:C), a synthetic double-stranded RNA, Toll-like receptor 3 (TLR3) agonist or Montanide ISA 720 adjuvant, an oil-water emulation. To elicit stronger immune response, Pichia pastoris yeast was used to produce the NLPs. Mice were immunized with each recombinant protein in combination with above. Although both NLPs were able to generate stronger immune response, with high antibodies titer levels and longevity, formulation containing NLP-CSPCT in the presence of Poly (I:C) was selected to be explored in future experiments. NLP-CSPCT with Poly (I:C) adjuvant presented a high frequency of antigen-specific antibody-secreting cells (ASCs) on days 5 and 30, respectively, in the spleen and bone marrow. Moreover, high IgG titers against all PvCSP variants were detected in the sera. Later, immunized mice with NLP-CSPCT were challenged with Pb/Pv sporozoites. Sterile protection was observed in 30% of the challenged mice. Therefore, this vaccine formulation use has the potential to be a good candidate for the development of a universal vaccine against P. vivax malaria.

Direcionamento de antígenos para células dendríticas in vivo: uma nova estratégia para o desenvolvimento de vacina na paracoccidioidomicose / Targeting antigens to dendritic cells in vivo: a new strategy for vaccine development in Paracoccidioidomycosis

A paracoccidioidomicose (PCM) é a micose sistêmica mais frequente no Brasil. Na última década, foi demonstrado que é possível enviar antígenos diretamente para as células dendríticas utilizando o anticorpo αDEC205 e na presença de um estímulo de maturação, o resultado é a indução de uma resposta imunológica. Verificamos que o anticorpo αDEC fusionado ao peptídeo P10 induziu uma resposta por células produtoras de IFN-γ após uma única dose em relação à administração de P10, mesmo tendo sido administrado em uma concentração menor. Entretanto, essa resposta não se manteve após segunda dose do anticorpo. Após desafio dos animais com P. brasiliensis, imunizados com duas doses do anticorpo quimérico, detectamos níveis de IFN-γ e IL-4 no tecido pulmonar estatisticamente maiores no grupo αDEC/P10 e ISO/P10 em relação à administração de P10, todos em presença de Poly I:C. Em ensaios de terapia, verificamos no pulmão de camundongos tratados com o anticorpo quimérico, principal órgão envolvido em modelo animal de PCM, baixa concentração de IFN-γ e IL-10 em relação aos controles. Em adição, ficou evidente que nos animais tratados com o anticorpo αDEC/P10 o tecido pulmonar está compatível com o tecido de animais não infectados, enquanto que na ausência de tratamento adequado encontramos aglomerados de leveduras e um tecido com aumento no infiltrado celular. Esses achados indicam uma boa evolução clínica em animais tratados e indicam que o direcionamento do P10 através do anticorpo quimérico αDEC/P10, na presença de Poly I:C, é uma estratégia promissora para terapia contra P. brasiliensis

Paracoccidioidomycosis (PCM) is the most common systemic mycosis in Brazil. In the last decade, it was demonstrated that antigens can be directly target to the dendritic cells using the antibody αDEC205 in the presence of a maturation stimulus, resulting in the induction of a strong immune response. We found that αDEC205 antibody fused to peptide P10 induced great response by IFN-γ producing cells after a single dose in relation to the administration of P10, although it has been administered in a lower concentration. However, this response was not maintained after second dose of antibody. Animals challenge with P. brasiliensis, after immunization with two doses of the chimeric antibody, produced high levels IFN-γ and IL-4 in lung tissue significantly higher in αDEC/P10 group in relation to the administration of P10, all in the presence of Poly I:C. In therapy assays, we found in the lungs of mice treated with the chimeric antibody, the main organ involved in an animal model of PCM, low concentration of IFN-γ and IL-10 compared to controls. In addition, it became evident that animals treated with αDEC/P10 antibody have a lung tissue much closer to that of non-infected tissue, while in the absence of suitable treatment we find clusters of yeasts and tissue filled with cellular infiltrates. Altogether, these findings show a clinical improvement in treated animals and indicate that targeting of P10 through the chimeric antibody αDEC/P10 in the presence of Poly I:C, is a promising strategy for therapy against P. brasiliensis

Pneumonite de hipersensibilidade / Hypersensitivity pneumonitis

Pneumonite de hipersensibilidade (PH) ou alveolite alérgica extrínseca é uma reação inflamatória imune que ocorre em indivíduos suscetíveis, devido à inalação de antígenos orgânicos e/ou inorgânicos. Esta patologia deve ser suspeitada quando houver relato de exposição a poeiras orgânicas. Relata-se um caso de PH em paciente masculino de 33 anos, com história de dispnéia, tosse, emagrecimento e febre, apresentando regressão da doença após interrupção da exposição a antígenos de aves. O diagnóstico geralmente é baseado na história e no exame clínico, confirmado pelo aparecimento de lesões típicas nos exames de imagem e pela biópsia pulmonar. O tratamento adequado resulta em melhora dos sintomas, do quadro imagético e do padrão espirométrico. O afastamento do agente causador usualmente regride a doença e a corticoterapia pode ser eficaz em reprimir a resposta inflamatória (AU)

Hypersensitivity pneumonitis (HP), or extrinsic allergic alveolitis, is an immune inflammatory reaction affecting susceptible individuals due to inhalation of organic and/or inorganic antigens. This pathology must be suspected if there is report of exposure to organic dusts. In this article a case of PH is reported in a 33-year-old male with history of dyspnea, coughing, weight loss, and fever, with regression of the disease after discontinuation of exposure to bird antigens. The diagnosis is usually based on history and clinical examination, confirmed by the appearance of typical lesions in imaging and pulmonary biopsy. Proper treatment results in improvement of symptoms, imaging picture, and spirometric pattern. The removal of the causal agent usually determines regression of the disease, and corticoid therapy may be effective in repressing the inflammatory response (AU)

Caracterização clinicopatológica da mamilite aguda em ovelhas lactantes infectadas experimentalmente com o herpesvírus bovino 2 / Clinic and pathological characterization of acute mammillitis in lactating ewes inoculated with bovine herpesvirus 2

A mamilite causada pelo herpesvírus bovino tipo 2 (BoHV-2) possui importante repercussão sanitária em gado leiteiro de alguns países, mas a sua patogenia permanece pouco conhecida. Este trabalho descreve a reprodução e caracterização da mamilite aguda em ovelhas lactantes inoculadas com o BoHV-2 na pele do úbere e dos tetos. Cinco de oito ovelhas inoculadas desenvolveram extensas placas com necrose focal, pequenas vesículas e formação de crostas nos locais de inoculação. As lesões foram inicialmente observadas no 4º dia pós-inoculação (pi), progrediram em extensão e gravidade até os dias 7-8pi e posteriormente regrediram. O vírus foi isolado das lesões entre os dias 7 e 8 pi. Antígenos virais e partículas típicas de herpesvírus foram demonstrados por microscopia eletrônica em biópsias de lesões coletadas nos dias 5, 6 e 10pi. Os achados histológicos foram caracterizados por necrose epitelial, erosões e úlceras, com formação de células sinciciais e infiltrado inflamatório linfoplasmocitário na derme. Associadas a essas lesões observaram-se inclusões eosinofílicas intranucleares em células epiteliais, sinciciais e inflamatórias. Em um segundo experimento, 7 de 10 cordeiros inoculados na mucosa nasal desenvolveram hiperemia e descarga nasal, bem como vesículas e erosões no focinho. O vírus foi isolado das secreções nasais por até três dias e todos os cordeiros soroconverteram ao BoHV-2. Tentativas de reativar a infecção latente pela administração de dexametasona no 40º dia pi foram infrutíferas, pois não foram observados re-excreção viral, recrudescência clínica ou soroconversão. Esses resultados demonstram que ovelhas são susceptíveis à infecção experimental pelo BoHV-2 e desenvolvem lesões semelhantes às observadas em casos naturais de mamilite herpética. Além disso, esses resultados sugerem o uso dessa espécie animal como modelo para o estudo de vários aspectos da biologia da infecção pelo BoHV-2.

Mammillitis caused by bovine herpesvirus type 2 (BoHV-2) is an important disease in dairy herds yet its pathogenesis remains largely unknown. This report describes the reproduction and characterization of acute mammillitis in lactating ewes inoculated with BoHV-2 in the skin of the udder and teats. Five out of eight inoculated ewes developed large plaques, with focal necrosis, small vesicles and crust formation in the inoculated areas. The lesions were first observed on day 4 post-inoculation (pi), progressed in size and severity up to days 7-8pi and subsided progressively thereafter. Infectious virus was isolated from the lesions at days 7 and 8pi. Viral antigens and herpesvirus-like particles were demonstrated by electron microscopy in lesions examined at days 5, 6 and 10pi. Histological findings included epithelial necrosis, erosions and ulcers, and formation of syncytial cells. Intranuclear inclusions bodies in epithelial, syncytial and inflammatory cells and lymphoplasmacytic inflammatory infiltrate in the dermis were also observed. In a second experiment, seven out of ten lambs inoculated into the nostrils and muzzle developed nasal hyperemia and discharge, vesicles, and erosions in the nose. Infectious virus was isolated from lesions during up to three days and all lambs seroconverted to BoHV-2. Attempts to reactivate the latent infection by dexamethasone administration on day 40pi failed, since virus shedding, clinical recrudescence or seroconversion were not observed. The reproduction of acute infection and mammillitis resembling that occurring in cattle paves the way for the use of sheep to study several aspects of the biology of BoHV-2 infection.

Identification and immunological characterization of Echinostoma liei antigens: preliminary study for validation of its use in schistosomiasis control program

Several studies have proposed the use of larvae of Echinostoma in schistosomiasis biological control program, since Echinostoma rediae attack and even destroy S. mansoni sporocysts probably by induction of host's inflammatory response when they are in the same molluscan. The objective of the present work was to identify and immunologically characterize E. liei antigens to be presented as a promising tool in schistosomiasis control program. Two E. liei antigens were prepared namely metacercarial and adult worm antigens in addition to Schistosoma soluble egg antigen [SEA] and Schistosoma worm antigen [SWAP]. Analysis of the four antigens by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis [SDS-PAGE] revealed a number of bands except for the metacercarial antigen of E. liei which appeared as a single band. Immunoblotting revealed three common bands between SEA, SWAP and E. liei worm antigen corresponding to 17, 29 and 97 kDa. Detection of specific total IgG and IgG4 isotype in sera of S. mansoni infected patients were measured by ELISA using all four studied antigens. The levels of both IgG and IG4 isotype showed no statistical significant difference between schistosomal SEA, SWAP and worm E. liei antigens. On the other hand, metacercarial antigen revealed statistically significant lower levels of both IgG and IgG4 when compared with schistosomal SEA [p< 0.05]. The highest sensitivity and specificity rates for detection of specific total IgG and IgG4 isotype were recorded when using schistosomal SEA. Owing to its rather promising results, further studies are needed to investigate the possible validity of using E. liei adult worm antigen in snail immunization against schistosomiasis especially in endemic areas where re-infection is commonly encountered

Diagnostic efficiency of Brucella soluble antigens in immunodiffusion tests and ability to differentiate Brucella abortus strain 19 vaccinated cattle

Foram comparados três antígenos solúveis: um hapteno nativo (NH) de B. melitensis 16M, um polissacarídeo (PS) obtido de B. abortus 1119-3 e outro polissacarídeo de cadeia O (O-Chain) originado também da última Brucella. Os testes de imunodifusão radial (RID) e imunodifusão em gel de ágar (AGID) foram confrontados com as três classes de soros bovinos: a) infectados naturalmente (n = 76), b) não infectados (n = 130) e c) vacinados com B19 (n = 61) reagindo a testes sorológicos clássicos. Foram determinadas a sensibilidade (Se), a especificidade (Sp) e a capacidade para discriminar vacinados (ADV). A Se mais alta (84,3%) no teste RID foi demonstrada pelo antígeno NH, enquanto os três antígenos tiveram 100% de Sp. O antígeno O-Chain teve 100% de ADV nesse teste. O teste AGID com estes antígenos demonstrou 100% Sp e ADV, enquanto o antígeno PS mostrou uma melhor Se (86,6%). Finalmente, por sua qualidade de produção e eficiência, os antígenos PS e NH representam uma alternativa segura e econômica para o diagnóstico suplementar da brucelose.

Antigenicidade endotelial nas doencas difusas do tecido conectivo

Os autores revisaram a literatura referente a presenca de anticorpos anti-endotelio principalmente nas doencas difusas do tecido conectivo. Estes pacientes apresentaram uma tendencia a manifestar clinicamente importantes alteracoes histologicas de vasos de diversos calibres e em diferentes localizacoes. Acredita-se que a presenca desses auto-anticorpos possam exercer importante papel na etiopatogenese e prognostico nessas afeccoes. Apresentaram ainda resultados preliminares obtidos em estudo da antigenicidade endotelial na doenca mista do tecido conectivo (DMTC).